人类生精细胞在培养过程中的分化与变形

王怀秀[1] 李弘1 袁彩霞1 曹莹丽1 秦琴[2] 白崇志3

【摘要】 目的 探讨体外培养条件下生精细胞向单倍体精子细胞分化以及精子细胞变形为精子的可能性。方法 对11例非梗阻性无精子症患者进行睾丸活检，将其中9份具有生精细胞的活检标本在终浓度为50 U/L卵泡刺激素 （FSH） 和1 µmol/L睾酮 （T） 的改良人输卵管液 （HTF） 培养液中进行体外培养，培养前及培养后24小时对标本中精子及其他细胞进行计数，计算各种细胞的比例；应用流式细胞仪对2例患者培养前和培养后24小时的细胞进行细胞倍体分析。结果 培养前精子比例为（17.7±8.9）%，培养24小时后为（25.6±10.3）%，培养后精子比例显著增加（P=0.004）。细胞倍体分析显示，培养前可见4n、2n和1n波峰，培养后4n波峰消失，1n波峰显著增宽和增高。结论 生精细胞体外培养可使生精细胞发生减数分裂，并使精子细胞向精子变形。北京家圆医院生殖中心王怀秀

【关键词】：无精子症；男性不育；生精细胞；流式细胞仪；减数分裂；细胞培养技术

The differentiation and spermiogenesis of human spermatocytes in culture

Wang Huaixiu1, Li Hong1, Yuan Caixia1, Cao Yingli1,Qin Qin2，Bai Chongzhi3

1Reproductive Medicine Unit of Shanxi Provincial Hospital,2Central laboratory of Shanxi Provincial Hospital,3 Central laboratory of Shanxi Provincial Traditional Chinese Medicine Research Institute (Taiyuan 030012)

Abstract Objective To investigate the possibility of differentiation and spermiogenesis of spermatocytes under in vitro condition. Methods Testis biopsy was done in 11 cases with non-obstructive azoospermia. Cells were prepared from 9 samples with spermatocytes and cultured in medium containing follicle stimulating hormone (FSH) 50U/L and testosterone (T)1µmol/L. Sperms and cells of other types were counted and the proportion of every cell type was calculated before and 24 hours after culture. Flow cytometry was conducted before and 24 hours after culture in 2 cases to analyse the ploidy of the cells. Results The proportion of sperm in 9 samples was (17.7±8.9)% before culture and （25.6±10.3)% after culture (p=0.004). Sperm increased significantly after culture. Flow cytometry demonstrated that the diagram of 4n、2n and 1n converted to 2n and broader 1n. Conclusion Meiosis of spermatocytes and the transformation of spermatid into sperm could arise in in vitro culture.

Key words:：spermatocytes; flow cytometry; meiosis; cell culture echniques

卵子胞浆内单精子显微注射技术（ICSI）的问世，使得严重少、弱精子症以及精液中没有精子，只能通过外科方法从睾丸或附睾中获得精子的不育男性获得生育机会。但是，对睾丸及附睾中也没有精子的患者，则缺乏有效的治疗手段。1998年，Tesarik将无精子症患者睾丸内的生精细胞在体外培养到精子细胞或成熟精子，再通过ICSI的方法使患者配偶获得妊娠[1]。其后，Tesarik以及其他学者对生精细胞培养进行了深入研究，但大多研究结果显示精子细胞增加，尚未见成熟精子显著增加的报道[2,3]。从2010年5月至2010年12月，我们对文献报道[2,3]的生精细胞体外培养方法进行了改进，对培养后生精细胞的分化以及精子细胞的变形情况进行观察，并利用流式细胞仪对培养前后细胞倍体情况进行分析，探讨改进后的生精细胞培养方法是否可以提高生精细胞分化率以及成熟精子的转化率。

对象与方法

一、对象

2010年5月至2010年12月因无精子症就诊行睾丸活检的患者11例，对送检剩余睾丸组织进行生精细胞培养。本实验经过医院辅助生殖技术伦理委员会审核通过，并向患者充分说明实验方案后，患者签署知情同意书。11例患者中，2例细胞分离时未发现生精细胞，病理诊断为曲细精管玻璃样变性，对9例含生精细胞的睾丸组织进行培养。

二、方法

局麻下行开放睾丸活检术，采取约2mm3睾丸组织。将1mm3左右睾丸组织送病理科进行组织学诊断，剩余活检标本在Earles液（美国 Sigma公司）中用注射针头撕扯并清洗，以去除红细胞。将经过处理的生精小管剪碎，沉淀，将细胞悬液离心，去上清，以适量Earles液将细胞团混悬。取少量细胞悬液，将细胞密度调整到20×106/ml,在显微镜下计数200个细胞，计算各种细胞比例。

选择2份细胞总数较多的悬液，于培养前后经处理采用流式细胞仪（Beckman Coulter F500）进行细胞倍体分析。用PI染料一步染色法进行染色，检验结果通过WinMDI软件（2.9版）进行处理。

统计学方法：采用SPSS.11.5统计学软件对各标本培养前后观察结果进行配对资料t检验。P<0.05为有统计学意义。

结果

显微镜下根据细胞大小及形态，培养液中的细胞可分为支持细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及成熟精子等，尚有少数圆形细胞难以确定细胞类型。精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞以及各级精子细胞的判断依靠细胞大小以及形态，不能保证分类准确；成熟精子的形态典型，不会发生分类错误。本研究主要关注培养过程中生精细胞分化并变形为成熟精子的结果。因此，本文仅对成熟精子占细胞总数的比例进行总结和统计。9例患者睾丸组织体外培养精子比例如表1所示。

表1 睾丸组织体外培养前及培养24小时后精子比例

病 例

培养前精子比例（%）

培养后精子比例 （%）

1

21

32

2

10

9

3

28

36

4

17

20

5

22

29

6

4

18

7

22

40

8

7

16

9

28

30

根据上表结果计算，9份标本精子占细胞总数比例在培养前为（17.7±8.9）%；培养24小时后为（25.6±10.3）%。经SPSS11.5统计学软件进行配对t检验，差异有统计学意义（P=0.004）。

流式细胞仪分析结果显示，2例患者培养前可见4n、2n和1n波峰，培养后4n波峰消失，1n波峰显著增宽和增高（图1）。结果提示初级精母细胞在培养过程中发生了减数分裂，单倍体的精子增加。

生精细胞培养前后倍体流式细胞分析结果

图1 A，C分别为例1和例2生精细胞培养前，可见4n峰； B：例1培养后4n峰消失， 1n 峰显著增高；D：例2培养后4n峰消失，1n峰和2n峰显著增高。

讨论

在临床上，不育症患者中无精子症的发病率约为6.36%，其中一部分为输精管道阻塞所致，一部分为精子发生障碍所致。1995年，Fishel首次报道了用睾丸内Sd精子体外受精获得妊娠[4]。其后，又有学者尝试应用Sa精子细胞进行体外受精获得妊娠[5,6]。但是，Sa精子细胞的体外受精率、妊娠率以及活产率显著低于利用Sd精子细胞的结果[7]。Balaban[8]等对睾丸内精子以及Sa精细胞的体外受精能力进行对照研究, 发现两组的受精率分别为73.5%和50%,优质囊胚形成率分别为53%和25%，孵化率分别为31.2%和0%。

由此可见，减数分裂后精子的变形以及细胞质成熟对于受精能力以及受精卵的发育具有重要影响。如果对精液中无精子，而且睾丸中也没有精子或精子很少的患者通过生精细胞培养获得成熟精子，将有可能提高ICSI后的妊娠成功率。

1998年，Tesarik等[9]对生精障碍患者的睾丸组织进行培养，获得了比较成熟的精子细胞，用这些精子细胞进行体外受精，有5例婴儿出生。此后，许多学者相继开展生精细胞培养的研究。实验表明，生精细胞的分化及精细胞的成熟需要支持细胞的作用，如果在培养系统中没有支持细胞，培养的生精细胞以及精细胞容易发生凋亡。在培养液中添加FSH，可以启动精母细胞的减数分裂以及精母细胞核的致密化和细胞浆的成熟。单独应用T对精子分化以及成熟无明显效果，但当与FSH合并使用时对生精细胞的减数分裂以及精子变态有促进作用，T的这一作用是通过防止支持细胞凋亡而实现的[10]。借鉴这些研究的成果，目前的生精细胞培养液中普遍添加FSH和T。

虽然生精细胞体外培养取得了一定成果，前景令人鼓舞，但是，目前由生精细胞转化为成熟精子的比例较低。刘锋等[2]对8例梗阻性无精子症患者用胶原酶消化睾丸组织离心3次后进行体外培养，初级和次级精母细胞转化为精子细胞的转化率为6.51%，其中大部分为Sb期（86/160,54%）精子细胞，精子细胞从Sa期发育为更成熟的Sc期的转化率约为5.74%。在6例非梗阻性无精子症患者得到1275个细胞，其中初级精母细胞为38%，其余为支持细胞和精原细胞。经过培养，最后得到22个精子细胞，由生精细胞转化为精子细胞的转化率为4.5%。在22个精子细胞中，Sb期精子细胞为15个。蔡志明[3]等用红细胞裂解液处理睾丸组织后对分离出的113个圆形精子细胞进行培养，其中4个转化为长形精子细胞，转化率仅为3.54%，而且所得到的长形精子细胞尚未达到精子阶段。

体外培养过程中生精细胞分化率以及精子细胞变形程度较低原因何在呢？从精原细胞到精子细胞需经过两次减数分裂，初级精母细胞的分裂前期需经过细线期、偶线期、粗线期、双线期以及终变期等减数分裂中的重要环节，精子细胞需经过长出鞭毛、细胞变长等一系列形态变化。在此过程中，生精细胞对各种机械或化学损伤非常敏感。文献报道在分离生精细胞时均采用胶原酶消化生精小管基底膜或用胰蛋白酶消化细胞间质，或采用红细胞裂解液去除红细胞；同时，为了去除上述酶及红细胞裂解液，尚需进行多次离心。而酶消化以及反复离心有可能对生精细胞分化以及精子细胞的变形产生不利影响。

在本研究中，我们采用机械方法分离生精细胞，而不是使用酶对生精小管进行消化；制备细胞悬液时没有反复离心。结果，培养后成熟精子比例较培养前明显增加。我们认为，尽最大可能避免对生精细胞施加化学及机械损伤可能是本实验生精细胞向成熟精子转化率较高的原因之一。

除在显微镜下观察到生精细胞向精子分化外，本研究还经流式细胞技术证实培养后四倍体细胞向二倍体和单倍体细胞发生了转化，进一步证明体外培养对生精细胞分化和成熟的价值。

但是，生精细胞体外培养还处在摸索阶段，还有许多问题需要探讨和研究。

在正常人体内，从初级精母细胞分化成熟为精子需要两个多月的时间。在体外培养的条件下，此过程一天之内即可完成。这可能是在体外培养时清洗、离心等过程将生理和病理情况下抑制生精细胞分化的因子部分洗脱掉所致。由于生精细胞分化和成熟的过程被大大缩短，精子核浓缩、突出、细胞体变长以及鞭毛生长等大大超过正常速度，各种形态变化易出现不协调，因此，体外培养时较多精子出现异常形态[9]。虽然Tesarik曾用培养所得的精子细胞体外受精获得了活产婴儿，但体外培养这一非生理性的过程对形成的精子质量是否会有影响，尚需进一步观察。

生精细胞在培养系统中存活时间大大短于一般体细胞，培养24-48小时，约20%细胞活力丧失，培养72小时，约60%细胞失去活力[2]。这可能是生精细胞培养液与体内环境存在较大差别所致。在体内，生精小管与血液循环之间有由基底膜构成的血睾屏障，这就使得生精小管的内环境与血液以及其它器官的组织液有很大差别。生精小管又因支持细胞的紧密连接分成近腔区与基底区两个区域。近腔区含蛋白质较少，K+、CL-较多，谷氨酸、谷氨酰胺浓度较高，还有较多的α巨球蛋白等，这些成分有的有利于细胞分化，有的提供代谢底物，有的抑制精子的顶体反应，为精子的发育提供较好的条件。基底区由于有表皮生长因子的存在，可使精原细胞进行有丝分裂。文献报道的生精细胞培养条件与生精细胞在体内的正常环境起码有以下不同：（1）所使用的培养液均为市售的用于卵子受精或体细胞培养的培养液，没有模拟生精小管内液体成分进行配制。实际上，目前对生精小管内液体成分虽然进行了一定研究，但还不能说完全清楚；（2）在体外培养系统中，精原细胞和精母细胞、精子细胞及成熟精子共处于同样的培养液中，没有基底区和近腔区微环境的区分。也就是说，体外培养条件对于生精细胞来说属于非生理环境，这一非生理环境可能会影响生精细胞的寿命，继而降低生精细胞分化发育成为成熟精子的效率。因此，要提高生精细胞培养的效果，还需要针对生精细胞对培养环境的特殊要求对培养系统进行研究。

通过生精细胞培养，有可能由于去掉了某些在体内阻抑生精过程的因子或者改变了某些病理因素从而恢复生精过程。但是，体外培养只是改变了生精细胞的外部环境，生精障碍的主要原因可能还在于基因变异以及由于基因变异所导致的核糖核酸以及蛋白质表达异常。Y染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因—无精子因子（AZF），该因子的部分或完全缺如会导致少精子或无精子症【11】。在减数分裂和精子发生过程中，小核糖核酸（RNA）具有多种生物学功能。比如，微小RNA可能参与精子发生中有丝分裂、减数分裂以及后减数分裂阶段的基因表达调节；与piwi蛋白相互作用的小RNA参与调节雄性生殖细胞减数分裂以及后减数分裂的过程，在精子发生中起抑制反转录转座子的作用[12]。因此，要搞清楚生精障碍的真正原因，从根本上解决生精障碍，还需要从基因以及蛋白质水平进行研究。

总之，精子生成是一个非常复杂的过程。研究精子生成的机制，弄清楚精子生成障碍的环节，改进生精细胞培养技术，将是男性不育领域的具有挑战性的重要课题。

参考文献

1、Tesarik J, Sousa M, Greco E, et al. Spermatids as gametes: indications and limitations. Hum Reprod, 1998c,13(suppl 3): 89-107

2、刘锋, 邹彦, 邓志华等.睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究. 第三军医大学学报, 2006, 28(14): 1535-1538

3、蔡志明, 石敏, 龙云等. 人睾丸圆形精子细胞在体外向长形精子细胞分化. 中华男科学杂志, 2006,12(7): 587-593

4、Fishel S,Green S,Bishop M, et al. Pregnancy after intracytoplasmic injection of spermatid. Lancet, 1995,345: 1641-1642

5、Vanderzwalmen P, Zech H ,Bikenfeld A, et al. Reproductive capacity of spermatozoa from men with testicular failure. Hum Reprod, 1999,14: 2796-2800

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8、Balaban B,Urman B,Isiklar A, et al. Progression to the blastocyst stage of embryo derived from testicular round spermatids. Hum Reprod, 2000,15(6): 1377-1382

9、Tesarik J, Guido M, Mendoza C et al. Human spermatogenesis in vitro: Respective effects of follicle-stimulating hormone and testostrone on meiosis, spermiogenesis and sertoli cell apoptosis. The Journal of Clinical Endocrinology & metabolism, 1998,83(12): 4467-4473

10、王怀秀. 生精细胞培养进展. 中国男科学杂志, 2011，25(1)：57-59

11、shi Y-C, Cui Y-X,Zhou Y-C et al A rare Y chromosome constitutional rearrangement : a partial AZFb deletion and duplication within chromosome Yp in an infertile man with severe oligoasthenoteratozoospermia Int.J .Androl 2011;34(5)461-9

12、孟雅楠，孟丽景，宋亚娟等. 小RNA分子与精子发生调控. 遗传, 2011,33(1):9-16

注：本稿字符数7548

稿件号47