那键 马超 许勇 王晖 秦泗通

（东南大学医学院附属徐州市中心医院骨关节科，221009）

关键词：骨质疏松症；分子生物学；机制徐州市中心医院关节骨科那键

老年骨质疏松症（Osteporosis,OP）是老年人的常见病，是以全身性骨量减少、骨的微观结构变化，致使骨脆性增加，强度下降，增加骨折发生危险性的全身性骨骼疾病。发病率在世界常见病中已经位居前十位，成为危害老年人身心健康及生命的重要原因之一。随着人口老龄化进程的加快，越来越受到社会各界的广泛关注。

骨质疏松的主要病理改变是骨矿含量和骨矿密度下降、骨的微结构紊乱和破坏[1]。骨质疏松发生的同时常常伴随退行性骨关节炎的发生，虽然病理改变存在一定差异，但均为退行性病变，并且表现出年龄与发病率的依赖性[2]。目前常从骨丢失率与峰值骨量获得二者平衡关系上来探讨骨质疏松的发病机理。一致的看法是一个低的峰值骨量结合较高的骨丢失可导致骨质疏松的发生。许多因素都与骨质疏松发生有关，比如雌激素、活性维生素D3、甲状旁腺激素（PTH）、降钙素、性别、年龄、和运动强度等等。

与骨关节炎（osteoarthritis,OA）的分子生物学机制有相似之处，很多证据证明了OP亦为多基因疾病[3]。多个基因中每一对等位基因的异常均可轻度增加OA的危险性，这种危险性的累积结果，由量变到质变引起OP发生。目前随着科学技术的进步，人们已经从分子生物学层面对骨质疏松的研究有了深入的了解，并在其基因遗传学、细胞因子的作用机制研究上取得了不小成就。下面将与本实验研究有关的骨质疏松发病机制的分子生物学层面因素做一个纵述。

1  老年骨质疏松症发生的相关因素

1.1  低密度脂蛋白受体相关蛋白5[15]（LRP5）

我国医学专家通过对骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征家族遗传信息的研究中发现，该综合征家族中携带突变的LRP5基因但未发病个体的骨密度较正常人群显著降低。国外有人对纯合子小鼠LRP5基因进行敲除后，表现出明显的骨质疏松和假性神经胶质瘤的发生。杂合子小鼠骨密度表现为较纯合子小鼠为低[4]。Koay等[5]按照骨密度从低到高的顺序研究了约1000个英国白种成年人的LRP5基因改变，结果得出了LRP5基因多态性与骨密度改变关系密切的结论，LRP5基因变异导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征携杂合子个体骨密度较常人显著降低，且易于发生成年型骨质疏松症。一系列研究表明，LRP5基因在骨密度调节中起重要作用。

1.2  I型胶原[15](CollagenI,COLLI)

I型胶原蛋白是机体内胶原蛋白的主要成分，存在于各种组织中，在骨组织中参与骨的形成，并且与骨代谢关系密切。骨抗张强度大小直接与胶原纤维有关，随着年龄的增长，I型胶原蛋白合成下降，骨组织脆性增加，骨折风险性增大。目前已经证明了2条α1链和1条α2链组成了COLLI，其编码基因COLIα1和COLIα2分别位于染色体17q21.3-22和7q21.3-22.1上。目前主要集中在对COLIα1基因的研究上。1996年Grant等[6]通过对COLIα1基因研究发现了其存在一个G/T多态的第1内含子区转录因子Sp1结合位点，有意义的现象是GG基因型的妇女骨密度较GT及TT基因型增加明显。Mann等[7]进一步对G/T多态性的研究发现，T等位基因增加了对Sp1蛋白的亲合力，使COLIα1基因转录增加，α1链三聚体的出现，导致骨强度下降。

1.3  雌激素受体基因[15]

雌激素受体(ER)基因多态性与骨密度关系密切。特别是绝经后由于机体内雌激素环境的巨大的改变，直接导致骨质疏松的发生。作为与雌激素作用相互藕联的雌激素受体，其功能变化也直接关系雌激素的作用效果。因而对雌激素受体的研究已经尤为重要。Albagha等报道了位于ERα基因(ESR1)第一内含子区的PvuⅡ、XbaI多态性与绝经后妇女骨密度关系密切，PPxx基因型者骨密度值明显降低。另有研究报道了ER-α基因多态性与骨密度有密切关系[8]，目前对雌激素受体(ER)基因多态性的研究尚有待深入。

1.4  雌激素

作为女性抗骨质疏松的主要激素，其作用非常重要。许多细胞因子都是直接或者间接通过调节雌激素的功能和表达量来发挥作用，同时雌激素反作用于这些细胞因子或者受体。在这些作用当中，雌激素处于核心的作用。雌激素作用于成骨细胞上ER-α，使细胞表达骨保护素（osteoprotegeri,OPG）。雌激素可抑制RANKL对破骨前体细胞向成熟破骨细胞的诱导分化[9]。雌激素缺乏可以降低与成骨有关的细胞因子OPG、TGF-β的表达，由于17β-雌二醇可以下调RANKL、M-CSF、TRAILmRNA表达，所以解除了对RANKL、M-CSF的抑制作用，导致RANKL、M-CSF表达增加，最终导致破骨活动的增强，骨质疏松的发生。TRAIL是与细胞凋亡关系密切，对TRAIL的调节说明了雌激素还可能通过细胞凋亡途径对成骨细胞和破骨细胞的数量进行调节[10]。IL-6和TNF-α是雌激素缺乏的早期作为旁分泌因素促进破骨细胞生成的重要细胞因子，与绝经后骨质疏松密切相关。雌激素缺乏可通过IL-7激活T细胞继而使CD4+细胞分泌TNF-α[11]。雌激素可以降低成骨细胞和骨髓基质细胞中IL-6基因和TNF-α基因表达。

1.5  骨保护素（osteoprotegeri,OPG）

OPG与作为RANKL的饵受体，通过竞争性的与RANKL结合，阻止破骨细胞的成熟分化而起到骨保护作用。已经成为骨代谢研究的热点。OPG基因的多态性是研究的侧重点。目前已经发现了12种的人OPG基因多态性。其中发现女性绝经后骨质疏松患者OPG基因启动子中245TyG209GyA、SNP与骨密度的基因调节有关[12,13]。

1.6  维生素D受体(VDR)基因[14]

 VDR通过与活性维生素D3的结合调节机体内钙磷代谢和骨矿化[15]。目前已经发现了VDR基因存在4个多态位点，任何一个位点的基因突变均可导致其受体功能的变化。特别是女性，VDR基因多态性与骨质疏松关系密切。

1.7  转化生长因子-β1（transforming growth factor TGF-β1）

有人在对日本的1500名65-70岁妇女的TGF-β1基因的碱基排列、雌激素水平、骨密度等指标进行了研究，发现有两个碱基对绝经后骨量丢失起重要作用。Takai等[16]发现在ST2和SC3T3-G2/PA6细胞中TGF-β1浓度依赖性的增加OPG Mrna的表达，抑制RANKL mRNA表达。

1.8  骨形态发生蛋白基因2（BMP-2）

BMP-2在骨的形成中起重要作用。冰岛遗传解码公司对该国200多个家族进行了分析，其中每个家族都包含多名骨质疏松患者。分析结果显示一些家族中的患者在人类20号染色体一个区域上具有遗传共性。在此基础上识别出了一个称为BMP-2的相关基因，并发现该基因有三个形态会增加骨质疏松的发病风险。携带这三个形态中的任何一种都有可能使人患骨质疏松的风险增加到正常人的3倍。

1.9  基质金属蛋白酶-1,2（matrix metalloproteinase,MMPs）

成骨细胞分泌MMPS，MMPs-1、MMPs-2在骨重建过程中起重要作用，二者通过对骨基质的降解，促进骨基质更新和矿化，增加成骨趋势。所以MMPS成为骨吸收与骨形成过程互相调节的偶联因子[17,18]。MMPs-2与成熟成骨细胞活性有关。Filanti等[19]报道成熟的成骨细胞较高地表达了MMPs-2，当成骨细胞接受到骨吸收的信号后，分泌MMPS降解成骨细胞下的I型胶原，从而激活破骨细胞，启动骨吸收过程发生。

1.10  降钙素（calcitoninCT）和降钙素基因相关肽（calcitoningene- related peptide,CGRP）

CT是由降钙素基因（calcitoningene）编码具有调节骨代谢作用的重要激素。1961年COPP等[20]发现CT。CT主要由甲状腺C细胞分泌，可与破骨细胞膜上的CT受体结合来抑制骨吸收[21]。并且已经应用于临床治疗骨质疏松。研究亦发现CGRP对骨代谢也起着重要的作用。Ballica等通过对小鼠CGRP基因的转染，使成骨细胞表达过量CGRP，结果明显的增加了骨密度，可能是CGRP促进了成骨细胞数量及功能增加。实验结果充分证明了CGRP对骨代谢的调节作用。CGRP是通过作用于成骨细胞和破骨细胞CGRP受体而发挥作用的。一个有趣的现象是生理水平的CGRP对破骨细胞不产生调节作用，只有高浓度CGRP释放到细胞的周围时才可产生作用。

1.11  甲状旁腺激素（PTH）

PTH是由甲状旁腺细胞分泌、具有重要作用的激素。一般认为PTH是破骨分解的骨代谢调节激素，其直接作用于骨和肾，促进骨钙动员和骨对钙的重吸收。PTH促进1-α羟化酶使25羟基维生素D3转为活性1,25二羟基维生素D3，间接调节肠道钙磷吸收。同时能促进前成骨细胞或未成熟的骨样细胞增生分化，阻止成骨细胞凋亡[22]。Miao[23]等亦发现了间歇性给予外源性PTH可以增强新生小鼠骨骼强度、增加成骨细胞形成，抑制成骨细胞凋亡。PTH还可以通过对骨保护素OPG与RANKL的反向调节有效的促进破骨细胞的分化与激活。PTH刺激成骨细胞分泌IL-6，使破骨细胞活化。所以PTH对骨代谢起着双重的调节作用。

1.12  白介素（Interleukin IL）

1998年Vidal[24]在对MG63的研究中发现，IL-1α呈浓度依赖性的方式增加OPG mRNA的表达。IL-6对OPG mRNA表达没有明显的作用。IL-18可以促进基质细胞和成骨细胞细胞OPG的表达。单核细胞和巨噬细胞分泌的IL-1、TNF-α、IL-6等细胞因子直接或间接地作用于OC前体，诱导其分化为成熟OC，促进骨吸收，导致骨质疏松发生。由于成骨细胞、单核细胞和T细胞产生的IL-6在骨组织中对破骨细胞活化作用，因而其在绝经后骨质疏松发生中具有重要作用[25]。另有研究证明了在绝经后妇女的IL-6基因变异与骨密度之间相互藕联[26,27]。

1.13  巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）

M-CSF及RANKL由成骨细胞和基质细胞分泌、是介导前体OC向OC分化的两个必需的细胞因子。M-CSF结合在前体OC受体c-Fms上、RANKL结合在前体OC受体RANK上。体外试验已经证明了经M-CSF、RANKL处理的的骨髓细胞在鼠胫骨皮质骨上培养出现TRACP阳性的多核破骨细胞，并且出现骨吸收凹。体外试验也证实M-CSF能诱导OC融合、延长OC的存活时间并引导其趋化运动[28]。

1.14  肿瘤坏死因子（TNF）

Brandstrom等[29]1998年研究证明了TNF-α和TNF-β可以以时间和浓度依赖的方式上调OPG mRNA表达。也有实验证明TNF-α能够刺激基质成骨细胞样细胞合成IL-6、IL-11、PTHrP，间接促进成骨细胞RANKL的表达，进而诱导前体破骨细胞的成熟分化。

1.15  前列腺素2（PGE2）

2001年Sugiyama[30]在对风湿关节炎患者成骨细胞系细胞的研究中发现，骨性关节炎患者合成PGE2的能力明显增高。这说明PGE2的表达量的变化参与了风湿性关节炎患者中炎症反应与骨质丢失。已经证明了PGE2对原代培养的人骨髓干细胞是以浓度和时间依赖性的方式调节的，由于抑制OPG mRNA的表达，推测PGE2通过OPG／RANK／RANKL系统发挥促进破骨细胞成熟分化，进而促进骨吸收作用。

1.16  活性维生素D3

活性维生素D3是机体内骨代谢过程中具有重要作用的细胞因子，通过促进钙吸收及骨形成、抑制骨钙丢失而发挥作用。Roodman等已经明确了1,25二羟基维生素D3对正常灵长类动物骨髓单核细胞向具有OC的特性的多核细胞诱导分化作用，CT可以对抗这一诱导功能。

1.17  OPG／RANK／RANKL系统

OPG/RANK/RANK系统是成骨细胞调节破骨细胞功能的重要系统[31]。作为破骨细胞生成的基本信号系统[25]在骨代谢中具有重要作用。多种细胞因子或激素最终通过此系统完成对破骨细胞的分化、成熟的调控。其中RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）是这一过程中处于核心地位的两个必需细胞因子。成骨细胞和基质细胞分泌的M-CSF和RANKL分别结合在前体OC 受体c-Fms、RANK上，诱导前体OC分化成熟OC[32,33]。OPG是RANKL的饵受体（decoy receptor），竞争性与RANK结合，抑制破骨细胞的分化、成熟，诱导其凋亡过程的提前发生。

RANKL、M-CSF的具体作用机制如下：成骨细胞和基质细胞在IL-1、IL-6、PGE、维生素D3等细胞因子及激素作用下分泌RANKL、M-CSF。M-CSF和RANKL分别结合在前体OC受体c-Fms和RANK上，协同发挥诱导作用。RANKL与RANK形成三聚体，募连细胞浆内TRAF6（肿瘤坏死因子活化因子6）与C-src（胞浆内蛋白激酶），刺激PI-3K/Akt轴（磷脂酰肌醇-3激酶/苏氨酸蛋白激酶轴），该轴是调控破骨细胞凋亡的重要通路。RANKL与RANK结合后的另一旁路重要通路是通过活化三个MAPKS（丝裂素活化蛋白激酶，包括c-Jun氨基末端激酶JNK，细胞外调节激酶ERKs，P38）而发挥作用[34]。OPG亦由成骨细胞和基质细胞表达，作为成骨细胞RANKL的饵受体，与RANK竞争结合RANKL，从而抑制OC成熟分化。由于多种激素和细胞因子均可通过调节OPG\RANK\RANKL系统发挥调节骨代谢作用。故雌激素下降后多种细胞因子的分泌异常是绝经后骨质疏松症的重要原因，同时高RANK\OPG浓度是决定OC发生的主要分子信号机制。

1.18  其他因素

Ⅱ型、Ⅸ型胶原等基因和其他一些细胞因子基因编码的蛋白质都参与了骨代谢活动的调控，这些基因的多态性及变异均可以导致骨代谢异常。因此对这些基因的研究现在已成为骨质疏松研究领域的热点。

2  研究新进展及展望

近年来发现了多种与钙离子的跨膜转运有关的通道。TRPV5和TPRV6为瞬时性受体电位通道（TRP）超家族中具有代表性的2个通道。国外有人对小鼠TRPV5基因进行敲除后，出现严重的钙离子代谢紊乱，表现出明显的高血钙及骨质疏松发生。证明了TRPV5、TPRV6对钙离子及骨代谢的作用。目前的研究主要集中在TRPV5和TRPV6在肾脏和小肠中表达及调节方面，在骨组织中的表达特点及调节机制尚不清楚。总之，随着对TRPV5、TPRV6研究的深入，为OP病因学及治疗上开辟了全新的领域。

参考文献

[1]   廖二元,谭利华.代谢性骨病学[M].北京:人民卫生出版社.2003,669.

[2]   郭世绂.性激素和细胞因子与骨关节炎及骨质疏松关系[J].国外医学内分泌学分册,2003,23(2):98-100.

[3]   Styrkarsdottir U,Halldorsson BV,Gretarsdottir S,et al. Multiple genetic loci for bone mineral density and fractures[J].N Engl J Med,2008,358(22):2355-65.

[4]   Kato,Millan S,Patel,Regis ewasseur,et al.Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation osteopenia and persistent embryonic eye vasculari- zation in mice deficientin Lrp5 a Wntcoreceptor[J].Cell Biol,2002, 157:303-314.

[5]   Koay MA,Woon PY,Zhang Y,et al.Influence of LRP5 polymorphisms on normal variation in BMD[J].J Bone Miner Res,2004,19:1619-1627.

[6]   Grant SF,Reid DM,Blake G,et al.Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl site in the collagen type-α1 gene[J].Nat Genet,1996,14:203-205.

[7]   Mann V,Hobson EE,Li B,et al.A COL1α1 Spl binding site polymorphism predisposes to osteoporotic fracture by affecting bone density and quality[J].Clin Invest,2001,107:899-907.

[8]   Becherini L,Gennari L,Masi L,et al.Evidence of a linkage disequilibrium between polymorphisms in the human estro gen receptor α gene and their relationship to bone mass variation in post menopausal Italian women[J].Hum Mol Genet,2000,9:2043-2050.

[9]   Schoppet M,Preissner KT,Hofbauer LC.Rank ligand and osteoprotegerin paracrine regulators of bone metabolism and vascular function[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(4):549-553.

[10] 苏欣,廖二元,彭健.雌二醇对人成骨肉瘤MG63细胞株护骨素-护骨素配体及相关因子的调节[J].中华内科杂志,2003,42(11):800-803.

[11] Toraldo G,Gao Y,Qien W,et al.Estrogen prevents bone loss By direct targeting of TNF producing CD4+ lymphocytesandCD4+ dependent regulation of CD8+ activation[J].J Bone Miner Res,2003,18(l2):S9.

[12] Arko B,Prezelj K,Komel R,et al.Sequence variations in The osteopro- tegerin gene promoter in patients with post Menopausalo steoporosis[J].Clin Endocrinol Metab,2002,87(9):4078-4079.

[13] Ohmori H,Mokita Y,Funamizu M,et al.Linkage and association analyses of OPG gene locus with human osteoporosis[J].Hum Genet,2002,47(8):400- 406.

[14] 朱国明,龚瑶琴.骨质疏松的分子遗传学研究进展.基础医学与临床[J].2005,25(11):967-974.

[15] Ferrari S,Bonjour J,Rizzoli R.The vitamin D receptor gene and calcium metabolism[J].Trends Endocrinol Metab(TEM).1998,9:259-264.

[16] Takai H,Kanematsu M,Yano K,et al.Transrorming growth factor-beta stimulates the production of osteoprotegerin/osteoclastoge-nesis inhibitory  factor by bone marrow stromal cells[J].Biol chem.1998,273:27091-27096.

[17]张红,罗湘杭,谢辉，等.基质金属蛋白酶-1、-2与女性年龄\骨转换生化指标及骨密度的关系.中华内科杂志[J].2006,45(4):306-309.

[18] Rifas L,Fausto A.Scott MJ,et al.Expression of metallo-proteinases and tissue inhibitors of metallo-proteinases in human osteoblast-like cells: differentiation is associated with repression of metallo-proteinase biosynthesis[J].Endocrinology.1994,134:213-221.

[19] Filanti C,Dickson GR,Di Martino D,et al.The expression of metallo proteinase-2,-9,and-14 and of tissue inhibitors-1 and-2 is developmentally modulated during osteogenesis in vitro,the mature osteoblastic phenotype expressing metalloproteinase-14[J].Bone Miner Res.2000,15:2154-2168.

[20] Copp DH,Davidson,AGF,Cheney BA.Evdence for a new parathyroid hormone which lowers blood calcium[J].Proc Canad Fed Biol Soc.1961,4:17.

[21] Neher R,Riniker B,Maier R,et al.Human calcitonin. Nature[J].1968,220:984- 986

[22] Machado do Reis L,Kessler CB,Adams DJ,et al.Accentuated osteoclastic response to parathyroid hormone undermines bone mass acquisition in osteonectin-null mice[J].Bone.2008,43(2):264-73.

[23] Cosmen F,Nieves J,Zion M,et al.Parathyroid hormone in women receiving alendronate[J].N Engl J Med,2005,353(6):566-75.

[24] Vidal ON,Sjogren K,Eriksson BI,et al.osteoprotegerin mRNA is increased by Interleukin-1alpha in the human osteosarcoma cell line MG63 and in human ostebolastlike cells[J].Biochem Biophys Res ommun,1998,248:696

[25] Manolagas SC. The role of IL-6 type cytokines and their receptors in bone [J].Ann NY Acad Sci ,1998,840:194-204.

[26] Murray RE,Mc Guigan F,Grant SF,et al.Polymor phisms of the interleukin-6 gene are associated with bone mineral density[J].Bone,1997,21:89-92.

[27] Tsukamoto K,Ohta N,Shirai Y,et al.A highly poly morphic CA repeat marker at the human interleukin6 receptor (IL6R) locus[J].J Human Genet.1998, 43:289-290.

[28] 车明学,李富春,谷贵山.新型钙离子通道TRPV5在骨质疏松症发病机制中的作用. 中国老年学杂志[J],2007,27(17):3370-3372.

[29] Brandstrom H,Jonsson KB,Vidal O,et al.Tumor necrosis factor-alpha and- beta upregulate the levels of osteoprotegerin mRNA human osteosarcoma MG63 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,248:454-457.

[30] Sugiyama T. Involvement of interleukin-6 and prostaglandin E2 in periarticular osteoporosis of postmenopausal women with rheumatoid arthritis[J].Bone Miner Metab,2001,19:89-96.

[31] Jakob F,Seefried L,Ebert R. Pathophysiology of bone metabolism Internist (Berl)[M],2008,49(10):1159-1160,1162-1164.

[32] Lacey DL,Timms E,Tan HL,et a1.Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast diferentiatio and activation[J].Cell,1998,93(2):165-176

[33] Bradley EW,Oursler MJ.Osteoclast culture and resorption assays[J].Methods Mol Biol,2008,455:19-35.

[34] 姚静,侯加法.OPG/RANKL/RANK系统的研究进展[J].动物医学进展,2006,27(2):5-9.