抑制核因子-κB对大鼠吻合肝动脉部分肝移植模型的保护作用...

前期的实验证实吻合肝动脉的大鼠部分肝移植术与不吻合肝动脉的大鼠部分肝移植术相比能明显减轻肝脏早期的缺血再灌注损伤(IRI)[1]，我们在建立吻合肝动脉的大鼠部分肝移植模型的基础上，对抑制核因子-κB (NF-κB) 在吻合肝动脉的部分肝移植模型早期IRI中的作用进行研究。南京医科大学第一附属医院普外科·肝胆中心孔连宝

一．材料及方法

1．实验动物分组：选取清洁雄性Spraque- Dawley 大鼠120只(由南京医科大学实验动物中心提供)，体重225～250g，配成60对。术前12h禁食，4h禁水。采用改良的二袖套法建立吻合肝动脉的小移植物模型，参照文献 [2, 3]，供体肝中叶为移植肝，其重量相对受体肝重量约37%(34%-43%)。60只受体大鼠随机分成A、B、C三组，对照组(A组，20只)：术后分别在30min, 2, 3, 6和12h 等5个时间点处死4只大鼠并采取肝组织及血清样本；缺血预处理组(IP)组(B组，20只)：供体及受体鼠术前分别阻断肝门血供15min，再灌注20min，余同对照组；二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC，购于Sigma 公司)组(C组，20只)：供体及受体鼠术前15min 尾静脉注射PDTC15mg/kg，余同对照组。

2．观察指标及方法：NF-κB 的测定采用免疫组化法，先将常规石蜡切片脱蜡至水，高温下抗原修复，加入NF-κB p65 单抗(购于美国Santa Cruz公司)，进行免疫组化染色。染色结果判定：NF-κB p65 活化细胞表现为胞浆、胞核黄或棕黄染色。按试剂盒说明书测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性(购于南京建成生物工程研究所)。ELISA 方法检测肿瘤坏死因子α (TNF-α)在血清中的表达。病理学检查：肝组织采取石蜡切片，H-E染色做常规病理学检查。

3．统计学方法：运用SPSS12.0软件进行分析，数据以均数±标准差( ±s)表示。两组间均数比较用t 检验。

二．结果

1．肝组织免疫组化染色结果：B 组和C 组(图B 和C )肝组织中NF-κB p65 细胞阳性率较A 组(图A )明显降低(P<0.05)，B组和C组比较无统计学意义(P>0.05)。

图1免疫组化染色 ×200

2．血清TNF-α ：B 组和C 组血清TNF-α 含量明显低于A 组(P<0.05)，峰值出现在术后3 h，B组和C组比较无统计学意义(P>0.05)。见表1

表1 术后血清TNF-α 表达水平（pg/mL, ±s ）

组别

0.5h

2h

3h

6h

12h

A

84.7±19.8*

150.6±31.6*

232.6±41.7*

218.3±56.1*

191.3±37.1*

B

64.3±18.7*

111.4±21.5*

163.4±51.4*

157.5±47.8*

139.8±33.9*

C

59.3±22.4*

121.6±32.7*

161.9±49.7*

151.3±51.0*

132.5±38.5*

注： *表示在同时间点B 组或C 组与A 组比较 P <0.05。

3．四组肝组织MDA 含量及SOD 活性变化：B 组和C 组肝组织MDA 含量明显低于A 组(P<0.05)，峰值出现在术后6 h，SOD 活性显著高于对照组(P<0.05)，B 组和C 组比较无统计学意义(P>0.05)。见表2和表3

表2 术后肝组织MDA 表达水平（nmol/mg, ±s ）

组别

0.5h

2h

3h

6h

12h

A

6.84±1.52

7.37±1.13

8.02±1.26

11.86±2.43*

8.61±2.17*

B

6.73±1.32

7.26±1.05

7.81±1.69

9.32±2.83*

7.45±2.31*

C

6.79±1.43

7.31±1.10

7.90±1.18

9.28±1.76*

7.87±1.41*

注：*表示在同时间点B 组或C 组与A 组比较 P <0.05。

表3 术后肝组织SOD 表达水平（NU/mg, ±s ）

组别

0.5h

2h

3h

6h

12h

A

72.3±16.1

79.0±17.9

71.0±16.7

50.7±11.9*

60.1±14.8*

B

74.9±13.8

75.9±11.3

66.6±14.7

61.8±13.1*

71.2±14.8*

C

73.9±12.9

75.5±16.4

67.1±11.2

58.8±17.9*

69.4±15.4*

注：*表示在同时间点B 组或C 组与A 组比较 P <0.05。

4. 病理改变：H-E 染色光镜下观察结果:A 组肝细胞排列紊乱，汇管区有大量炎性细胞浸润，见图2(A)；而B 组和C 组，肝细胞排列相对整齐，炎细胞浸润明显减少，见图2(B、C)。

图2  H-E染色 ×400

三．讨论

研究证实，IRI能导致移植物早期损伤或移植物功能延迟，而针对肝脏IRI的早期干预有助于改善移植肝存活及功能。研究发现肝移植再灌注阶段导致肝组织的损伤的过程中NF-κB起着重要作用，NF-κB 是一种具有多亚基、多向性调节作用核蛋白因子，在缺血后再灌注时NF-κB 被激活，继而受其调控的如TNF-α 和诱导性一氧化氮合成酶等靶基因表达增强，这些靶基因的诱导表达，致使大量炎性细胞聚集于病灶区，释放大量自由基，是IRI重要原因[1, 4, 5]。

有研究表明IP 能明显抑制NF-κB 活性，减轻炎症反应[6]。本研究结果显示，在IP 组和PDTC 组的NF-κB 阳性率明显弱于对照组，证实了IP 和PDTC 能有效抑制在吻合肝动脉的部分肝移植模型肝组织中NF-κB 的表达，继而明显减轻氧自由基对肝组织的损伤。说明在吻合肝动脉的部分肝移植模型中缺血再灌注时NF-κB 起着十分重要的作用，多种途径阻断NF-κB 的表达，对小移植具有保护作用。

参考文献

[1]       孔连宝，吴晓峰，邵立军等。吻合肝动脉对大鼠部分肝移植早期损伤的影响。中华实验外科杂志，2006,23: 543-545.

[2]       Kamada N, Sumimoto R, Kaneda K, et al. The value of hepatic artery reconstruction as a technique in rat liver transplantation. Surgery, 1992; 11: 195-200.

[3]       钱建民，汤黎明，胡建平等。大鼠肝移植小移植物模型的研究。中华实验外科杂志, 2003, 20: 275-277.

[4]       吴晓峰，钱建民，王学浩。诱导性一氧化氮合成酶在大鼠肝移植小移植物模型早期损伤中的表达及意义。中华实验外科杂志，2004, 7: 821-823.

[5]       钱建民，张浩，吴晓峰。核因子-κB和诱导性一氧化氮合成酶在大鼠肝脏小移植物缺血预处理中的作用。中华实验外科杂志，2005, 2: 171-173.

[6]       马跃峰，李相成，姚爱华等。缺血预处理对大鼠肝脏移植物再灌注早期NF-κB 活性的影响及意义。中国普外基础与临床杂志, 2006, 13 : 531-534.